FAQ Mykoplasmenfreie Zellkultur
Produkte Mykoplasmenfreie Zellkultur
Reagenzien für mykoplasmenfreies Arbeiten
Die Kontamination von Zellkulturen mit Mykoplasmen ist eines der Hauptprobleme in der zellbiologischen Forschung, da sie die Physiologie der Zelle beeinflussen bzw. ändern. Wegen ihrer parasitären Eigenschaften und der guten Anpassung an die Wirtszellen finden sich Mykoplasmen häufig als Kontamination in Zellkulturen.[1]
Mykoplasmen besitzen keine Zellwand. Aus diesem Grund sind sie gegenüber Antibiotika, wie sie häufig in der Zellkultur angewendet werden (z.B. Pen/Strep) unempfindlich, da diese auf die bakterielle Zellwandsynthese abzielen. Das Fehlen einer Zellwand in Kombination mit ihrer geringen Größe (typischerweise 0,2 – 0,3 μm) erschwert aber auch ihren Nachweis mit konventionellen Mikroskopen. Ihre geringe Größe und ihre sehr flexible Form bedingt zudem, dass Mykoplasmen nicht durch Sterilfiltration aus flüssigen Medien entfernt werden können.
Mykoplasmen bleiben auch wegen des Fehlens von makroskopischen Effekten oftmals sehr lange Zeit unentdeckt. Gerade beim routinemäßigen Arbeiten mit Standard-Antibiotika fällt ein Befall der Zellkultur mit Mykoplasmen, insbesondere durch das Laborpersonal lange Zeit nicht auf, da die Kontamination mit anderen Bakterien durch die zugesetzten Antibiotika selektiv verhindert wird, während die gleichzeitig mit eingeschleppten Mykoplasmen sich ungehindert vermehren können.
Es erscheint vor diesem Hintergrund kaum verwunderlich, dass verschiedene Studien eine Kontamination von bis 40% der Zellkulturen mit Mykoplasmen ergeben haben. Als mögliche Ursachen für diese hohe Zahl an Kontaminationen gelten die Einschleppung durch das Laborpersonal, Medien, Seren, Trypsin, Kreuzkontaminationen bereit infizierter Zellkulturen oder die Gewinnung von Zellkulturen aus bereits infizierten Organismen.[3]
Literatur:
1. H.G. Drexler, C. Uphoff; Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. Photo: M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer: „Zell- und Gewebekultur“; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1987); R.J. Hay, M.L. Macy, T.R. Chen; Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]
Da das Vorhandensein einer Kontamination die Ergebnisse, die aus Zellkulturen gewonnen werden, verfälschen bzw. im schlimmsten Fall das Wachstum der Zellen so stark beeinträchtigen kann, dass es zum Totalverlust der Kultur kommt, müssen Zellkulturen routinemäßig auf Mykoplasmenbefall untersucht werden. Speziell im Falle der Transfektion von Zellen muss eine Kontamination mit Mykoplasmen auf jeden Fall ausgeschlossen werden, da durch ihren negativen Einfluss auf das Wachstum und die Stoffwechselaktivität der Zellen die Transfektionseffizienzen drastisch absinken.
Kleine Ursache – große Wirkung: Mykoplasmen
Bei Mykoplasmen handelt es sich um eine von mehreren Arten parasitisch oder kommensalisch mit Menschen, Tieren und Pflanzen lebenden Bakterien aus der Klasse der Mollicutes. Die über 100 bis heute bekannten Arten der Gattung Mycoplasma beschränken sich per Definition auf Wirbeltiere als Wirte, wo sie als Erreger für zahlreiche Krankheiten (z.B. Lungenentzündung durch Mycoplasma pneumoniae) bekannt sind.
Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Mykoplasmen-Kolonie auf einer Zelloberfläche [2]
Mykoplasmen zeichnen sich besonders durch ihre geringe Größe und das Fehlen einer Zellwand aus. Deswegen sind auch Antibiotika, die die Zellwände angreifen, bei Mykoplasmen wirkungslos. Das Genom ist mit 0,58 – 1,38 Megabasenpaaren bei einem niedrigem GC-Gehalt (18 – 40 mol%) das kleinste aller zur Autoreplikation befähigten Prokaryonten.
Mykoplasmen sind als Aerobier bis fakultative Anaerobier ideal an ihre Wirte angepasst und finden gerade deshalb unter Zellkulturbedingungen (37°C) optimale Wachstumsbedingungen vor.
Mykoplasmen ...
...beeinträchtigen das Zellwachstum
...verringern die Stoffwechselaktivität der Wirtszellen
...modulieren die zelluläre Cytokinproduktion
...induzieren chromosomale Aberrationen in vitro
...passieren Standard-Sterilfilter
...sind unempfindlich gegenüber üblicherweise in der Zellkultur eingesetzten Antibiotika wie Penicillin oder Streptomycin
...sind resistent gegenüber hohen Temperaturen und Austrocknung
...beeinträchtigen die Transfizierbarkeit von Zellen
Kontamination mit Mykoplasmen:
In nahezu allen bekannten Zelltypen können sich Mykoplasmen parasitär vermehren, was eine ubiquitäre Verbreitung zur Folge hat. Hauptkontaminationsquellen sind Laborpersonal, aber auch Trypsin und FBS, beides über tierische Quellen erzeugte Zellkulturadditive. Die meisten Anbieter dieser Medien können lediglich für Mykoplasmenfreiheit unterhalb der Detektionsgrenze garantieren, was jedoch ein unzureichendes Kriterium darstellt. Schon eine einzige Zelle sorgt für die Durchseuchung eines kompletten Zellkulturansatzes. Die Abbildung zeigt den Effekt einer Mykoplasmen-Kontamination auf das Wachstum von HeLa Zellen.
Einflussnahme der Mykoplasmen auf die Transfektionseffizienz:
Das Besondere an einer Mykoplasmen-Kontamination ist, dass sie optisch nicht sichtbar ist und nicht zum Zelltod führt, weshalb sie über einen sehr langen Zeitraum unentdeckt bleiben kann. Trotzdem beeinträchtigen diese Bakterien in ganz erheblichem Maße den Transfektionserfolg:
- • Aufgrund des hohen Bedarfs der Mykoplasmen an Arginin wird das Zellwachstum erheblich eingeschränkt
- • Mykoplasmen modulieren die Zytokin-Produktion der Zelle
- • Mykoplasmen verursachen chromosomale Abberationen
- • Mykoplasmen halten sich in der Zellmembran auf, wodurch Zellmembranvorgänge, wie Endozytose, moduliert werden können.
Alle hier beschriebenen Einflüsse der Kontamination auf die physiologischen Prozesse der Zelle sind auch wesentlich am Transfektionsprozess beteiligt. Eine erhebliche Beeinträchtigung der Transfektion ist somit nicht verwunderlich und zeigt sich in der Graphik anhand von HeLa und HepG2 Zellen. Mit den kontaminierten Zellen konnten jeweils nur 17 und 5.6 % der normalen Transfektionseffizienz erreicht werden.
Es wurden Hela- und HepG2-Zellen mit pCMVßgal auf 48 Well-Platten transfiziert. Die spezifischen Absorptionswerte wurden mittels ONPG- und BCA-Assay ermittelt.
Gängige Nachweismethoden zur Mykoplasmendetektion
DAPI-Färbung
Eine sehr häufig eingesetzte Methode zum Nachweis von Mykoplasmen ist die Färbung mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol). DAPI interkaliert in die kleine Furche der DNA und zeigt dort unter UV-Anregung eine blaue Fluoreszenz mit einem Maximum bei 460 nm. In unbefallenen Zellkulturen sind lediglich die Zellkerne angefärbt, während in kontaminierten Kulturen die DNA der an der Zelloberfläche befindlichen Mykoplasmen ebenso gefärbt wird. Aufgrund der geringen Größe können einzelne Mykoplasmenzellen nicht aufgelöst werden, erst bei einer sehr großen Zahl äußert sich ihr Vorhandensein durch einen oft nicht eindeutig identifizierbaren Schleier um die Zellkerne.
PCR
Eine demgegenüber weitaus empfindlichere und verlässlichere Nachweismethode stellt die Polymerasekettenreaktion (PCR) dar, mit deren Hilfe eine Kontamination durch Mykoplasmen bereits in einem sehr frühen Stadium und bei sehr niedriger Konzentration detektiert werden kann. Dieses Verfahren lässt sich im Zelllabor routinemäßig einsetzen.
Sonstige
Oft werden ELISA-Tests für den routinemäßigen Nachweis von Mycoplasmen eingesetzt. Diese Methode ist dem DAPI-Test jedoch bezüglich ihrer Sensitivität und Spezifität keineswegs überlegen. Weiterhin wäre die Elektronenmikroskopie zu nennen, die jedoch einen sehr viel höheren apparativen und zeitlichen Aufwand erfordert.
Fazit
Zum Nachweis von Mykoplasmen bieten wir daher eine Reihe PCR-basierter Mycoplasmen Test-Kits an:
MycoSPY® (konventioneller PCR Test-Kit)
MycoSPY® Master Mix (PCR Test-Kit als Master Mix mit integriertem Loading Buffer und Tracking-Farbstoffen für die Gelelektrophorese)
Diese Produkte können sowohl bei etablierten Zelllinien als auch bei Primärzellen eingesetzt werden.
Vergleich MycoSPY® und DAPI-Färbung zur Erkennung von Mykoplasmen
 |
Mit DAPI gefärbte Cos7-Zellen ohne |
Der Befall dieser HepG2-Zellen mit |
 |
Diese mit DAPI gefärbten H441-Luc-Zellen |
Ein eindeutiger Nachweis wird bei |
| Methode | DAPI-Test | ELISA | MycoSPY® | Electron microscopy |
|---|---|---|---|---|
| Aufwand | + | + | + | −− |
| Kosten | ++ | 0 | + | −− |
| Empfindlichkeit | −− | − | ++ | + |
| Gesamt | + | 0 | ++++ | −−− |
Behandlung von mit Mykoplasmen kontaminierten Zellkulturen
Zur Behandlung von Zellkulturen, die mit Bakterien kontaminiert sind bieten sich Antibiotika an. Antibiotika, die an der Zellwand ansetzen (z.B. Penicilline) sind jedoch gegenüber Mykoplasmen praktisch unwirksam.
Mit dem Produkt MycoRAZOR® bieten wir daher ein Antibiotikagemisch an, dessen Wirkung auf der Inhibierung der Proteinbiosynthese (Transkription und Translation) beruht.
